实现选择性单胚胎移植 囊胚技术是关键

「摘要」 规避多胎妊娠风险较好的方法是选择性单胚胎移植，同时冷冻保存剩余胚胎。而囊胚的培养和移植在生理学上与子宫内膜同步性最大。因此大部分学者认为囊胚培养和冷冻尤为重要，特别是冷冻后选择囊胚腔扩展起来的囊胚移植。目前评估胚胎主要依靠形态学评估方法。本中心囊胚形成率为53.35%。

关键词    选择性单胚胎移植，囊胚

The blastocyst culture is very important for elective single embryo transfer

ZHONG Ying

(Reproductive Medicine Center,Jingjiang Maternal and Child Health Hospital, Hhengdu, Sichuan 610051, China)

Abstract  A good strategy to avoid multiple pregnancies is single embryo transfer (SET) with freezing of spare embryos. Blastocyst culture and transfer is adapted to physiological procedure, and resulted embryo-uterine synchrony. Therefore, More scholars believe that blastocyst culture and blastocyst vitrification is more important. The choice frozen blastocyst transfer should depend on blastocyst expansion after vitrification in blastocyst vitrification. Presently , morphology and cleavage rate used in many centers remain the mainstay of embryo assessment. In our center, blastulation rates was 53.35%.

Key words  Selective single embryo transfer, Blastocyst

1、囊胚培养的意义

自1978年,体外受精—胚胎移植已作为不孕症治疗的主要措施。随着该技术的不断发展，临床妊娠率有了很大的提高，但并发的多胎率增加了围产期母婴安全的风险，且其他健康风险仍将延续至围产期以外。如何在保证妊娠率的同时又能降低多胎率，成为目前辅助生殖领域研究的关注焦点。2002年欧洲人类生殖与胚胎年会提出：“单胎分娩是ART的首选结局，双胎妊娠应当视为ART的一项并发症。”；国际生育协会联盟（IFFS）提出的健康IVF结局：第一，关注育龄期妇女的健康改善公共卫生状况和目前保健最为重要，第二，推广单胚胎移植，尤其对可具备胚胎冷冻条件的机构，第三，建议全胚冷冻，通过复苏移植单个冻融胚胎直至妊娠，减少母亲产科不良预后的发生，减少出生婴儿围产期的伤害。因此选择性单胚胎移植是目前公认有效地解决这一问题的关键。在单胚胎移植中更多的学者认为，单囊胚的移植和囊胚玻璃化冷冻是保证累计妊娠率的重要因素。

2、实施囊胚培养前需明确的几个问题

胚胎实验室在保证正常受精、正常受精卵的比例、及胚胎在相对客观可评估的形态学评分体系中有序进行，且种植前胚胎在不同发育阶段均有成熟的冷冻标准和实施方案，是行囊胚培养的基础。如何在囊胚培养的过程中对胚胎进行评价、如何选择性的进行囊胚培养、如何提高囊胚冷冻的效率是实施囊胚培养前需明确的几个问题。

2.1  胚胎序贯评分系统

在体外受精-胚胎移植技术中，卵子和胚胎质量是影响妊娠结果的重要因素。目前对胚胎评估多依据形态学，在复杂的形态学评分系统中，建立一套符合自己中心特点的评分系统，本中心的经验是细化形态学来帮助我们选择具有发育潜能和种植能力的胚胎。

胚胎形态学评估是一个连续的动态的过程，主要包括卵母细胞、原核、早卵裂、卵裂期及囊胚期。目前认为理想的成熟卵母细胞胞浆清亮、均质，细胞质颗粒均匀清晰、无空泡、碎片、无颗粒状暗区，极体呈圆形或椭圆形、表面光滑，卵周隙小，透明带清晰，卵母细胞质量对其后胚胎发育至关重要[1,2]。Scott原核评分系统[3]辅助预测囊胚形成及胚胎发育的潜能。早卵裂胚胎是对受精25~27小时后对胚胎卵裂情况的观察，有报道早卵裂[4]能有效的辅助判断具有高种植潜能的胚胎。分裂期胚胎的形态学评分，胚胎发育速度、卵裂球均匀度、有无多核、碎片量常作为胚胎评分标准。卵裂球大小与其非整倍体比例有关,而多核的出现会严重地削弱胚胎的种植潜能[5]，碎片减少了正常细胞分裂的胞浆，影响胚胎卵裂球的紧密连接，碎片量在20%-40%，47%胚胎有染色体不正常[6]，而且碎片位置在卵裂间隙可引起不正常的融合和囊胚形成[7]，降低囊胚形成率、胚胎植入率并伴随凋亡和染色体异常率增加。我中心胚胎实验室主要依据原核数目、卵裂速度、卵裂球均匀度、多核、空泡、碎片程度这几方面对胚胎进行评估。

目前囊胚评分系统有两种:Gardner和Dokras评分法，本中心主要是依据Gardner等[8，9]1990年提出的两步评分系统：第一步根据囊胚的扩张和孵化程度将其评分：1期：早期囊胚，囊胚腔小于胚胎体积的一半；2期：囊胚腔大于胚胎体积的一半；3期：囊胚腔几乎充满整个胚胎；4期：扩张囊胚，囊胚腔大于早期囊胚，透明带变薄；5期：正在孵出的囊胚，囊胚的一部分从透明带孵出；6期：完全孵出的囊胚。再对3-6期囊胚的内细胞团和滋养层细胞评分： 内细胞团的评分：A级细胞数多，紧密；B级细胞数少，松散；C级细胞数很少。滋养层细胞的评分：A级上皮细胞层由较多细胞组成，机构紧密；B级上皮细胞层由少的细胞组成，机构松散；C级上皮细胞层由稀疏细胞组成。形态学上评价囊胚的三个部分与种植率有密切的关系，作为单独的因素滋养层细胞（数目和大小）对种植的影响最大；扩展和内细胞形态对种植的影响相对低些。

2.2 选择性的囊胚培养

欧洲一些国家实施选择性单囊胚移植的标准为[10]：①第一个或第二个促排卵周期，②女方年龄小于36岁，③D3有4个以上的优质胚胎。本中心根据自己实验室的评分系统特点，通过形态学序贯的观察，胚胎评估方法培养囊胚的指标为：①≥35岁D3达到4枚或以上的优质胚胎，②＜35岁D3达到3枚或以上的优质胚胎，③＜35岁D3达到2枚优质胚胎和3枚以上的3级8细胞胚胎，则建议继续培养至囊胚。本中心2008.1—2011.1月，≥35岁囊胚形成率为：48.51%；＜35岁的囊胚形成率为：54.34%。根据本中心的评分系统，优质胚胎的囊胚形成率为79.79%，3级胚胎的囊胚形成率为：69.10%。4级胚胎的囊胚形成率为12.30%。

2.3 囊胚的玻璃化冷冻技术

完善稳定的冷冻技术是实现选择性单胚胎移植的有力保障。大量的研究表明，玻璃化囊胚冷冻复苏较卵裂期冷冻复苏有更高的临床妊娠率、种植率及活产率。特别是累积活产率更需要依赖于冷冻技术。本中心自2008年全部采用玻璃化冷冻技术，冷冻保护剂为7.5%DMSO+7.5%EG+5%HSA基础液和15%DMSO+15%EG+0.5M Sucrose+5%HSA基础液。复苏液为0.35M Sucrose、0.2M Sucrose、5%HSA+基础液，冷冻载体为冷冻环。本中心2008.1—2010.1囊胚冷冻复苏存活率91.82%、妊娠率63.67%、种植率48.95%、多胎率37.01%、分娩率51.62%。

3、实验室的培养条件

实施选择性单胚胎移植特别是单囊胚移植，实验室培养条件是基础。囊胚培养延迟了胚胎在体外的时间，研究认为低氧环境使氧自由基产物减少，并可结合或破坏培养基中的某些毒素，从而提高囊胚形成率。目前序贯培养液的使用为囊胚培养提供了保证。序贯培养液是根据胚胎不同发育阶段的需求而设计的，满足了胚胎的生理需求和营养物质的需要，因此囊胚形成率较高。目前本中心使用的Thermo Forma三气培养箱，气体浓度为：CO26%, O25%, N289%，采用Cook Medical成品序贯培养液进行培养。采用微滴分组方式培养。目前本中心的囊胚形成率为53.35%，与Ebner[11]报道相似。

4、国内外囊胚培养的现状

ART治疗中降低多胎妊娠妊娠率，减少胚胎移植数目是一个有效的措施，关键是如何找到一个合适的切入点，既能不影响妊娠率的同时又有效的降低多胎率。实施单囊胚移植是方法之一，于此同时要求胚胎实验室具备稳定完善的培养条件，以期获得较高囊胚的形成率，并且囊胚冻融技术将有力保证患者的累计妊娠率。

综上所述，在拥有良好胚胎实验室培养条件、序贯的胚胎形态学评分系统和稳定的冻融技术下，实施选择性单囊胚移植是可行的。

参考文献

[1] Ebner T, Moser M, Tews G. Is oocyte morphology prognostic of embryo developmental potential after ICSI[J]. Reprod Biomed Online,2006,12(4):507-12.

[2] Sun YP, Xu Y, Cao T, et al. Zona pellucida thickness and clinical pregnancy outcome following in vitro fertilization[J]. Int J Gynecology Obstet,2005, 89(3):258-62.

[3] Sott L, Alvero R, Leondires M, et al. The morphology of human pronuclear and implantation[J]. Hum Reprod, 2000, 15(11): 2391-2403.

[4] Bos-Mikich, Mattos Al, Ferrari AN. Early cleavage of human embryos: an effective method for predicting successful IVF/ICSI outcome[J].Hum Reprod, 2001, 16 (12):2658-2661.

[5] Hardarson T, Hanson C, et al. Human embryos with unevenly sized blastomeres have lower pregnancy and implantation rates: indications for aneuploidy and multi-nucleation[J]. Hum Reprod, 2001, 16(2):313-8.

[6] Munne S, Cohen J. Chromosome abnormalities in human embryos[J].Hum Reprod Update,1998, 4:842-55.

[7] Alikani M, Cohen J, Tomkin G, et al. Human embryo fragmentation in vitro and its implications for pregnancy and implantation[J]. Fertil Steril,1999,71:836-842。

[8] Gardner D, Schoolcraft W. In vitro culture of human blastocysts[M].In: Jansen R, Mortimer D, eds. Toward reproductive certainty:fertility and genetics beyond 1999. Carnforth, UK: Parthenon Publishing, 1999:378-88.

[9] Gardner DK, Surrey E, Minjarez D, et al. Single blastocyst transfer: a prospective randomized trial[J]. Fertil Steril,2004: 81: 551-5.

[10] Guerif F, Frapsauce C, Chavez1 C, et. al. Treating women under 36 years old without top-quality embryos on day2:a prospective study comparing double embryo transfer with single blastocyst transfer[J]. Hum Reprod, 2011, 1 (2):1-7

[11] Ebner T, Shebl O, Moser M, et al. Group culture of human zygotes is superior to individual culture in terms of blastulation, implantation and life birth[J]. Reproductive Bio Medicine Online, 2010(21),762-768.